VIRUS TETELO DENGAN METODE RT-PCR DAN REA
Newcastle disease (ND) atau tetelo yaitu penyakit respirasi sistemik yang menular dan memicu kematian unggas berbagai umur,
tetelo dipicu oleh virus Avian paramyxovirus serotipe I (APMV-I) yang
termasuk dalam genus Avulavirus , famili Paramixoviridae, ordo Mononegavirales.
Strain virus tetelo dibedakan menjadi 4 golongan atau patotipe berdasar virulensinya yaitu mesogenic, lentogenic, viscerotropic velogenic, neurotropic velogenic,
Identifikasi virus tetelo dilakukan dengan teknik pengujian molekuler dan
konvensional , Sekuensing asam amino protein fusion (F) virus tetelo didahului dengan reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) dapat dipakai untuk membedakan patotipe virus tetelo dengan tanda keberadaan leusin dan fenilalanin pada cleavage site,
Teknik restriction endonuclease analysis (REA) dipakai untuk membedakan virus tetelo strain avirulen dan virulen melalui pemotongan DNA pada
restriction site dengan enzim tertentu,
Kombinasi antara REA dan RT-PCR menjadi pilihan untuk identifikasi patotipe virus tetelo , untuk menentukan patotipe virus tetelo pada ayam broiler secara cepat memakai teknik reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) yang diikuti teknik restriction endonuclease analysis (REA) dengan enzim Hin1l. agar memberikan informasi identifikasi patotipe virus tetelo secara mudah ,
Amplifikasi gen penyandi protein F virus tetelo dilakukan dengan Roche Transcriptor One-Step RT-PCR Kit (nomor katalog: 04 655 877 001) dimulai dari satu siklus reverse transcription pada suhu 50 ° C selama 30 menit dan initial denaturation pada suhu 94 ° C, selama 7 menit. Proses amplifikasi PCR terdiri dari 40 siklus yang terbagi menjadi 3 tahapan yang dimulai dari tahap denaturation pada
suhu 94 ° C selama 10 detik, kemudian tahapan annealing pada suhu 50 ° C selama 30 detik, dan tahap terakhir extention pada suhu 68 ° C selama 30 detik. Tahapan berikutnya yaitu final extention pada suhu 68 ° C selama 7 menit dan diakhiri dengan proses soak dengan suhu 4 ° C selama 3,5 detik, Produk
hasil RT-PCR dipisahkan dengan proses elektroforesis kemudian divisualisasikan pada gel agarose UltraPureTM Invitrogen (nomor Katalog: 16500-100) 1,5%.
contoh yang dipakai dalam penelitian ini merupakan hasil isolasi RNA virus tetelo
pada ayam broiler dari telur ayam berembrio specific antibody negative (TAB SAN) , 4 isolat yang dipakai dalam penelitian diberi kode BR1, BR2, BR3,
dan BR4, Hasil isolasi RNA dipakai sebagai template amplifikasi gen penyandi protein fusion (F) virus tetelo dengan memakai sepasang primer khusus, primer A dan primer B , pada Tabel dibawah ini
Tabel Primer gen penyandi protein F virus tetelo,
Kode : Sense : Sekuen Primer : Produk PCR :
A + 5'-TTGATGGCAGGCCTCTTGC-3'
363 bp
B - 5'-GGAGGATGTTGGCAGCATT-'3
Penelitian ini memakai 4 isolat virus tetelo pada ayam broiler yang sudah melalui proses isolasi RNA dari suspensi virus tetelo pada telur ayam berembrio
specific antibody negative (TAB SAN). Isolat RNA kemudian dipakai sebagai template pada amplifikasi gen F virus tetelo dengan metode RT-PCR. Produk hasil RT-PCR dipisahkan dengan proses elektroforesis kemudian divisualisasikan pada gel agarose 1,5%. Produk RT-PCR yang dihasilkan berukuran 363 bp ,
Penentuan urutan basa nukleotida dengan sekuensing dilakukan untuk menentukan urutan asam amino yang menentukan struktur protein dan fungsinya. Hasil sekuensing kemudian didiagnosa memakai program MEGA 6.06
dengan melakukan multiple alignment neighbor joining antara sekuen nukleotida
isolat uji dan data gen penyandi protein F virus tetelo dari Genbank. Perbedaan asam amino pada cleavage site dipakai sebagai acuan penentuan patotipe virus tetelo, Gen F menjadi target amplifikasi dalam penentuan patotipe virus tetelo sebab memiliki peran dalam penentuan virulensi, Strain virus mesogenic dan velogenic termasuk dalam golongan virulen dengan sekuen 112R/K-R-Q-K/R-R116 dengan fenilalanin pada cleavage site, sedang strain virus lentogenic termasuk dalam golongan avirulen .dengan sekuen 112G/E-K/R-Q-G/E-R116 dan
leusin pada cleavage site, Strain virus tetelo velogenik memiliki 2 pasang residu asam amino basa di sekitar cleavage site.
Strain lentogenic virus tetelo hanya terdapat dua residu asam amino basa tunggal pada critical position cleavage site.Dengan melihat urutan sekuen asam amino dan cleavage site dapat ditentukan patotipe virus tetelo,
Strain mesogenic memiliki dua pasang residu asam amino basa atau arginin tunggal dan sepasang lisin/arginin pada critical position cleavage site.
Isolat BR1 dan BR4 mengenai sekuen asam amino 112G-R-Q-G-R116 dan leusin
pada cleavage site sehingga digolongkan dalam strain virus tetelo lentogenik atau avirulen,
Hasil elektroforesis produk amplifikasi gen F virus tetelo (363 bp). [M]: DNA
ladder 100 bp; [K(+)]: kendali positif yang berasal dari live vaccine; [K(-)]: kendali
negatif; [BR1, BR2, BR3, BR4]: isolat yang memperlihatkan hasil positif,
Hasil ektroforesis produk RT-PCR yang diikuti dengan REA. [M]: DNA
ladder 100 bp; [K]: kendali yang berasal dari produk amplifikasi yang tidak dipotong enzim restriksi; [BR1; BR4]: produk amplifikasi yang terpotong menjadi beberapa fragmen DNA oleh enzim restriksi; [BR2; BR3]: produk amplifikasi yang tidak terpotong oleh enzim restriksi,
Hasil diagnosa sekuen asam amino memperlihatkan kesesuaian dengan hasil
penentuan patotipe virus tetelo metode REA dengan enzim Hin1l yaitu keduanya
memperlihatkan dalam strain virus tetelo lentogenik. contoh uji BR2 dan BR3
mengenai sekuen asam amino 112R-R-Q-KR116 dan fenilalanin pada cleavage site
sehingga digolongkan dalam strain virus tetelo mesogenik atau
virulen,
4 produk amplifikasi positif tetelo dibedakan patotipenya dengan metode REA
memakai enzim restriksi Hin1l yang diperoleh dari bakteri Haemophilus influenza
RFL, Enzim ini mampu membedakan patotipe virus tetelo berdasar pola
pemotongan DNA yang dapat divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarose 2,5%. Sekuen pengenalan enzim Hin1l adalah 5’…G
R ↓ C G Y C… 3’ dan 3’…C Y G C ↑ R G… 5’ , yaitu R mewakili basa purin dan Y
mewakili basa pirimidin. berdasar sekuen pengenalan yang dihasilkan enzim Hin1l dapat membedakan virus tetelo avirulen dan virulen ,
Virus tetelo virulen tidak memiliki sekuen pengenalan Hin1l sehingga DNA virus tetelo tidak terpotong oleh enzim Hin1l sedang virus tetelo avirulen memiliki sekuen pengenalan Hin1l sehingga memperlihatkan pola pemotongan
tertentu pada elektroforesis gel agarose setelah diinkubasi selama 3 jam. Visualisasi hasil elektroforesis produk RT-PCR yang diikuti dengan REA ,
terpisahnya DNA menjadi beberapa fragmen pada contoh uji BR1 dan
BR4 memperlihatkan adanya sekuen pengenalan yang menjadi tempat menempelnya enzim restriksi dan melakukan pemotongan pada sekuen itu. Jumlah fragmen yang dihasilkan dipengaruhi oleh panjang sekuen
pengenalan,
Enzim Hin1l yang mengenai sekuen pengenalan sepanjang 6 pasang basa
memotong untai DNA BR4 dan BR1 pada 2 tempat yaitu pada nukleotida ke 262 dan nukleotida ke 249 sehingga menghasilkan 3 pola pemotongan DNA pada elektroforesis gel agarose 2,5% yaitu 13 bp, 249 bp dan 101 bp,
Visualisasi elektroforesis gel agarose 2,5% BR2 dan BR1 memperlihatkan DNA terpisah menjadi 2 fragmen yaitu pada 101 bp dan 249 bp sedang fragmen 13 bp tidak tervisualisasi sebab ukurannya terlalu kecil.
berdasar pola pemotongan fragmen yang terbentuk, isolat uji BR4 dan BR1 digolongkan sebagai strain virus tetelo avirulen. Produk amplifikasi BR3 dan BR2
tidak memperlihatkan terjadinya restriksi DNA dibuktikan dengan fragmen DNA yang tetap utuh selain itu contoh tetap sejajar dengan kendali uncutting, Ketiadaan sekuen pengenalan pada BR3 dan BR2 memperlihatkan bahwa kedua isolat uji itu tergolong dalam strain virus tetelo virulen. diagnosa dengan
CLC sequence viewer 7.0.2 untuk melihat sekuen pengenalan enzim Hin1l pada isolat uji. Rekapitulasi hasil penentuan patotipe virus tetelo
dengan teknik RT-PCR dan REA pada Tabel bawah
Tabel. Rekapitulasi hasil penentuan patotipe virus ND dengan teknik RT-PCR dan REA
Kode Hin1l (bp) RT-PCR Strain
isolat (asam amino 112-117)
BR1 13/101/249 G R Q G R L Avirulen/ lentogenic
BR2 363 R R Q K R F Virulen/ mesogenic
BR3 363 R R Q K R F Virulen/ mesogenic
BR4 13/101/249 G R Q G R L Avirulen/ lentogenic
