INDUKSI SEL SOMATIK MENJADI SEL PUNCA PLURIPOTEN
Sel punca embrional manusia lebih menguntungkan dibanding
sel embrional binatang percobaan, namun penelitian pada Sel punca embrional manusia masih terkendala etika, Pemrograman inti sel untuk menghasilkan sel
pluripoten menghasilkan sel iPS yang dihasilkan dari induksi sel somatik manusia yang sudah terdiferensiasi, Transfeksi 4 gen faktor transkripsi, yaitu Klf4,Oct3/4, c-Myc dan Sox2, memakai vektor virus ,tidak berbasis gen atau cara lain tanpa integrasi virus, namun memakai protein rekombinan dapat menginduksi sel somatik menjadi sel punca pluripoten, Namun, masih terdapat kendala yang terkait masalah mutasi,perkembangan tumor, efisiensi dan kecepatan transduksi, Penelitian perlu .dilakukan untuk membandingkan genom sel hasil program ulang dengan genom sel asalnya.
masalah ada pada seleksi jenis sel somatik yang paling mudah didapat dalam jumlah cukup dengan waktu singkat dan mampu diprogram ulang dengan
efisien dan cepat ,Selain itu, belum ada penanda menonjol untuk sel hasil de-diferensiasi, itu menandakan masih terbatasnya pengetahuan tentang mekanisme epigenetik selama proses de-diferensiasi.
sejak tahun 1989, penelitian sel punca embrional sudah menghasilkan ratusan galur sel punca pluripoten embrional manusia melalui fertilisasi in vitro. penelti berhasil memprogram ulang sel fibroblas mencit menjadi sel punca pluripoten melalui integrasi gen gen terkait pluripotensi memakai vektor
Retrovirus.
sel punca pluripoten tidak hanya dapat diinduksi dari sel mencit, namun
juga dari sel manusia yang terbukti secara .fungsional dan molekular serupa dengan sel .punca embrional, Potensi aplikasi sel punca pluripoten hasil
induksi (iPSCs ,induced-Pluripotent Stem Cells ) dari sel somatik di bidang biomedik bisa dimanfaatkan untuk patologi penyakit, cara alternatif penapisan zat-zat embriotoksik dan teratogenik, penelitian efektivitas obat, dan terapi
sel. Sel iPS yang dikembangkan dari sel pasien .tidak akan menimbulkan reaksi penolakan jaringan bila ditransplantasikan kembali pada para pasien itu karena kesamaan profil genetik,
Sebagain sel punca dengan karakter pluripotensial, sel iPS dapat didiferensiasi menjadi sel yang berasal dari ketiga lapisan endoderm, mesoderm, embrional:ektoderm, Sel somatik yang dipakai untuk menghasilkan sel iPS bisa diambil dari pasien usia lanjut dan pasien penyakit genetik,
sel iPS berhasil dikembangkan dari sel fibroblas pasien berusia 80 tahun penderita familial Amyotrophic Lateral Screlosis (ALS) - suatu kelainan
neurodegeneratif; sel iPS itu berhasil didiferensiasi menjadi motor neuron, yaitu tipe sel yang rusak pada penderita ALS, Agar dapat dipakai dalam terapi sel, sel pluripoten ( sel punca embrional dan sel iPS ) harus dapat berdiferensiasi menjadi jenis sel yang dibutuhkan untuk reparasi jaringan resipien, Dalam percobaaan pada mencit dan katak Xenopus laevis ,sel pluripoten mampu berdiferensiasi menjadi 7 kelas sel pada retina dan memiliki penanda fotoreseptor dan bisa mengorganisasikan mata yang .berfungsi normal untuk melihat,
Sel iPS yang ditransplantasikan pada otak fetus mencit dapat bermigrasi ke berbagai bagian otak dan berdiferensiasi menjadi neuron dan sel glia
termasuk katekolaminergik ,subtipe glutamanergik dan GABAergik,
yang secara fungsional sudah terintegrasi dengan jaringan otak pasien,
sel iPS yang didiferensiasikan menjadi sel dopaminergik pada otak mencit
model penyakit Parkinson terbukti dapat memperbaiki gejala penyakit,
SEL PUNCA
Sel punca adalah sel yang berpotensi berkembang menjadi berbagai jenis
sel dengan tipe berbeda pada awal kehidupan, Sel punca juga ada di jaringan dewasa, seperti sumsum tulang dan saluran cerna tempat mereka
membelah dan menggantikan sel yang rusak,
3 jenis sel punca, yaitu sel punca pluripoten hasil induksi dari sel somatik (induced pluripotent stem cells) ,sel punca embrional (embryonic stem cells) dan sel punca dewasa (non-embryonic/somatic/adult stem cells),
Sel iPS adalah sel dewasa yang mengalami de-diferensiasi atau pemrograman ulang inti sel menjadi sel yang keadaannya serupa sel punca embrional dengan cara mendorong ekspresi gen dan faktor yang memberikan ciri pluripotensial, Sel iPS yang dihasilkan memiliki sifat sel punca pluripoten, mengekspresikan penanda sel punca, dan dapat membentuk tumor yang mengandung jenis sel yang berasal dari ketiga lapisan embrional (teratoma),
FAKTOR-FAKTOR YAMANAKA
Oct3/4 atau POU5F1 adalah faktor transkripsi dari keluarga POU yang terekspresi secara menonjol di sel punca embrional, embrio dan sel embrional, Adanya 1 salinan gen Oct3/4 mengakibatkan sifat pluripotensial dipertahankan oleh sel punca embrional, namun overekspresi Oct3/4 dua kali lipat menyebabkan diferensiasi ke arah endoderm dan mesoderm primitif,
Sox2 adalah faktor transkripsi dari keluarga Sox (SRY related HMG-box)
yang terekspresi pada sel punca saraf, sel embrional, sel punca embrional dan
embrio,
c-Myc adalah faktor transkripsi helix-loophelix/leusine zipper, yang diregulasi oleh STAT3 dan berperan pada pemunculan sifat pluripoten sel punca embrional mencit,
Embrio yang tidak mengekspresikan Sox2 akan mati karena tidak dapat membentuk ektoderm primitif (epiblast), sementara gangguan ekspresi Sox2 mengakibatkan sel berdiferensiasi dengan cepat,
Faktor trankripsi ini berperan pada pertumbuhan, diferensiasi, proliferasi sel dan merupakan suatu proto-onkogen yang berperan pada patogenesis kanker karena menyebabkan akselerasi siklus sel dari tahapan G ke S1,
Klf4 adalah faktor transkripsi serupa Kruppel (Kruppel-like Factor) yang pertama kali dikenal sebagai suatu supresor tumor pada kanker saluran cerna.
faktor ini diketahui mengalami overekspresi pada sel kanker skuamosa dan kanker payudara sehingga Klf4 dihubungkan dengan sifat supresor tumor sekaligus sifat onkogenesis, Overekspresi ektopik Klf4 menghambat proliferasi sel sehingga berlawanan dengan efek c-Myc,
PEMROGRAMAN ULANG INTI SEL
pemrograman ulang inti dilakukan dengan memakai teknik,antaralain :
a. Lineage switching, yaitu konversi langsung sel somatik menjadi
sel somatik jenis lain dengan overekspresi gen faktor transkripsi tertentu,
b.Induksi sifat pluripoten, melalui transfeksi gen faktor transkripsi yang mampu menginduksi sifat pluripoten dengan bantuan virus.
c.Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT), yaitu transplantasi inti sel somatik ke dalam sel telur yang sudah dikeluarkan inti selnya,
d.Fusi sel yaitu penggabungan 2 sel somatik dengan menambahkan inhibitor pembelahan sel sehingga kedua inti tetap terpisah dan membentuk suatu heterokarion,
Overekspresi dari gabungan 4 faktor transkripsi, yaitu Klf4 ,Oct3/4, Sox2 dan c-Myc, menghasilkan koloni yang kemampuan proliferasinya,morfologinya, karakteristik molekulernya menyerupai sel punca embrional,
MEKANISME INDUKSI PLURIPOTEN
Mekanisme semua cara di atas diperkirakan terjadi melalui dekondensasi
kromatin sehingga strukturnya mengambil bentuk terbuka, itu memungkinkan
terjadinya perubahan epigenetik berupa hiperasetilasi histon H3/H4, demetilasi sekuens promotor menonjol, seperti Oct-4, aktivasi telomerase hingga telomer memanjang, dan hiper-di/tri-metilasi lisin-4 pada histon H3,
terjadi penurunan metilasi gen pluripoten yang aktif sementara ekspresi
gen somatik menurun, Pada sel punca pluripoten, hasil induksi dengan keempat faktor Yamanaka diperkirakan mengakibatkan promosi replikasi DNA oleh c-Myc sehingga struktur kromatin mengendur dan Oct3/4 dapat mencapai gen targetnya, yang kemudian menyandi faktor transkipsi, membentuk jejaring faktor transkripsi pluripoten ,
Klf4,Oct3/4, Sox2, bersama-sama mengaktivasi proses epigenetik yang menimbulkan epigenom pluripoten.
sudah ada teknik induksi sel punca pluripoten , induksi dengan 3 faktor tanpa c-Myc atau Sox-2 berhasil menciptakan sel iPS, beberapa virus, seperti Adenovirus ,Retrovirus dan Lentivirus , telah dipakai untuk transfeksi gen atau teknik tanpa integrasi virus, seperti dengan protein rekombinan dan plasmid,
Setiap cara memiliki kelebihan dan kelemahan, namun sampai saat ini pemakaian Lentivirus dan Retrovirus masih merupakan cara yang paling efisien, Pemrograman ulang memakai Retrovirus sebagai vektor sering dipakai dan memiliki efisiensi transduksi yang baik pada hepatosit dan epitel lambung , Retrovirus yang dipakai adalah jenis yang tidak mampu melaksanakan replikasi di dalam sel target dan tidak mengakibatkan lisis dan kematian sel. Kekurangannya adalah memerlukan sel yang dapat aktif membelah agar
terjadi transduksi. Sel saraf resisten terhadap infeksi dan transduksi memakai Retrovirus, DNA Retrovirus berintegrasi dengan genom sel target sehingga memicu resiko mutasi insersional yang menyebabkan kanker.
Lentivirus adalah subklas Retrovirus yang dapat menginfeksi sel yang tidak atau sedang membelah dan berintegrasi dengan genom target, RNA
virus mengalami reverse-transcription menjadi DNA dan masuk ke genom sel target saat pembelahan sel. Sama seperti Retrovirus, integrasi gen Lentivirus dapat mengakibatkan aktivasi onkogen dan menimbulkan tumor, namun
predisposisinya lebih rendah dibandingkan Retrovirus. Vektor Lentivirus yang dapat dikendalikan dengan doxycyclin memungkinkan kendali atas
ekspresi keempat faktor transkripsi, sehingga dapat dilakukan penelitian
molekuler dan biokimiawi yang terjadi selama proses pemrograman epigenetik,
pemakaian plasmid berpeluang proses pemrograman ulang tanpa adanya
integrasi dengan genom sel target, sehingga menghasilkan sel iPS yang bebas virus. Namun efisiensi transfeksi memakai plasmid ini masih tetap lebih rendah dibandingkan memakai Lentivirus dan Retrovirus , Plasmid episomal dapat melakukan replikasi autonom secara ekstrakromosomal tanpa integrasi
dengan genom sel, sehingga durasi ekspresi gen lebih lama, pemakaian Adenovirus yang tidak dapat melakukan replikasi sudah dilakukan, Adenovirus dapat menginfeksi semua sel, kecuali sel limfosit, mampu mengekspresikan gen lebih baik ,tidak melakukan integrasi dengan genom sel target,
Kekurangannya adalah Adenovirus menghilang dengan cepat pada sel yang membelah sehingga ekspresi gen tidak cukup lama, menghasilkan efisiensi yang rendah,
cara terakhir adalah teknik langsung memakai protein untuk pemrograman
ulang, tidak mengandalkan proses transkripsi dari gen hasil transfeksi, Protein itu dikonjugasikan pada peptida pendek yang mampu membantu transdsuksi protein, seperti poli-arginin dan HIV tat ,Suatu domain transduksi protein poli-arginin dikonjugasikan, dengan ujung terminal C pada keempat faktor
transkripsi. Faktor transkripsi rekombinan terdeteksi 6 sampai 72 jam setelah -induksi dalam sel fibroblas embrional mencit; protein ini tetap stabil dan mampu melakukan translokasi ke inti sampai dengan 48 jam sesudah -induksi.
Proses pemrograman ulang memerluka waktu 7 sampai 10 hari; induksi berulang sebanyak 4 kali setiap 36 jam menghasilkan sel iPS yang secara fungsional morfologis, molekular serupa dengan sel punca embrional,
pemakaian protein rekombinan mampu menghasilkan sel iPS tanpa adanya modifikasi genom sel target, Teknik induksi sel punca pluripoten dari sel
somatik sudah dikembangkan, teknik yang memakai Lentivirus dan Retrovirus masih yang paling efisien meski integrasi gen virus ,besarnya modifikasi genom yang terjadi pada sel target, adanya aktivasi onkogen, tetap menjadi kendala ,
Teknik yang memungkinkan tidak adanya integrasi virus, dan sedikitnya modifikasi genom sel target, seperti memakai protein rekombinan, Adenovirus,
plasmid, transposon, masih harus disempurnakan karena kendala rendahnya
efisiensi dan terlalu singkatnya ekspresi gen ektopik sebelum mengalami inaktivasi , Perlu dipertimbangkan pemakaian molekul, seperti asam valproat, suatu inhibitor deasetilasi histon dan molekul kecil lain, misalnya miRNA (micro RNA),siRNA (small interfering RNA) ,
Sel punca jaringan lemak (Adipose-Derived Stem Cell, ADSC) berasal dari lipoaspirat yang mudah diperoleh . 300 mililiter lipoaspirat dapat menghasilkan 100 juta sel punca hanya dengan 2 hari kultur, jauh lebih cepat dari sel lain yang memerlukan 4 minggu ekspansi untuk mencapai jumlah yang cukup
agar dapat ditransduksi. Efisiensi ADSC , 2 kali lebih cepat dan 20 kali lebih baik dan tidak memerlukan dukungan sel feeder mencit sehingga risiko kontaminasi dari sel feeder dapat dieliminasi, Jenis sel ini lebih mudah didapat dalam jumlah besar dalam waktu singkat, lebih efisien, dan waktu pemrograman ulang lebih singkat,
Keberhasilan proses induksi sel somatik menjadi sel iPS dipengaruhi oleh tingkat diferensiasinya dan jenis sel target , sel dengan tingkat diferensiasi lanjut lebih sulit diprogram ulang, sering memakai sel fibroblas kulit karena sel ini mudah diperoleh dan mudah dikultur meski efisiensinya cenderung di bawah 0.01% dan dibutuhkan 3 sampai 4 minggu sampai munculnya koloni sel iPS. Sel punca saraf fetus dapat diprogram ulang memakai Oct4 saja, meski sulit diperoleh pada manusia. Keratinosit 3 kali lebih cepat dan 100 kali lebih efisien untuk diprogram ulang dibandingkan sel fibroblas, sel CD34 dari darah perifer mudah didapat dalam jumlah besar dan efisiensinya pada rata rata 0,01 sampai 0,02%; melanosit memiliki ekspresi Sox2 yang tinggi
sehingga dapat diinduksi dengan tiga faktor saja, efisiensinya 0,05%, dan koloni sel iPS terbentuk lebih cepat dalam 10 hari ,
pemanfaatan sel iPS sangat luas, pada kedokteran regeneratif, sel iPS
berpotensi dipakai pada terapi sel. Pasien dengan penyakit tertentu yang memerlukan donor sel dapat memakai selnya sendiri yang akan diinduksi menjadi sel iPS dan ditransplantasikan kembali untuk berdiferensiasi sesuai kebutuhan jaringan pasien tanpa risiko reaksi penolakan jaringan,
yang perlu diperhatikan sebelum proses translasi ,antaralain :
melakukan sequencing DNA koloni sel iPS yang akan dipakai dalam terapi,
melenyapkan genom virus yang terintegrasi ,melenyapkan risiko terbentuknya tumor , protokol diferensiasi yang efisien,
Genom sel hasil induksi lalu dibandingkan dengan genom sel pasien sehingga
mutasi yang terjadi selama proses transduksi dapat diketahui,
Sel iPS menjanjikan di bidang penelitian dasar Tidak adanya kendala
etika seperti pada sel punca embrional menyebabkan penelitan sel iPS meningkat
identifikasi sel iPS wajarnya dilakukan dengan cara membandingkannya dengan sel punca embrional. Secara morfologis, akan tampak pembesaran inti sel dan peningkatan rasio inti sel terhadap sitoplasma, Sel ini
dapat dikenali dengan cara melihat kapasitasnya dalam membentuk sel dari ketiga jenis lapisan embrional pada binatang percobaan, adanya pola transkripsi dan epigenetik yang serupa,,reaktivasi gen pluripoten, inaktivasi kromosom X pada sel perempuan,
chimera yang berasal dari sel iPS dapat membentuk sel benih, belum ada Penanda khas sel yang berhasil diprogram ulang ,peneliti memakai fosfatase alkali, SSE-4 ,inaktivasi dan aktivasi ekspresi TRA-1-60, DNMT3B, Rex1,
Nanog, sebagai penanda sel iPS
FOTO Skema terapi memakai sel iPS pada kedokteran regeneratif
FOTO Skema Transfeksi Gen
FOTO Beberapa cara pemrograman ulang sel; EB Embryoid Body, iPS induced Pluripotent Stem Cell.
FOTO Skema proses induksi sel donor menjadi sel iPS memakai transfeksi gen dan protein rekombinan, dengan bantuan molekul kecil
