KLONING GEN WINGLESS-TYPE MMTV INTEGRATION SITE FAMILY MEMBER
4 (WNT4) MENCIT UNTUK ANTIGEN BARU DALAM SISTEM KEKEBALAN TUBUH OKONTRASEPSI
Penelitian ini untuk mengungkap sumber antigen baru dalam sistem kekebalan tubuh okontrasepsi melalui kloning gen Wnt4 yang diisolasi dari mencit Swiss Webster, kesuksesan kloning gen Wnt4 memicu penelitian antigen baru
dalam metode sistem kekebalan tubuh okontrasepsi untuk meregulasi fertilitas hewan, terutama hewan liar yang berperan sebagai hama atau reservoir
penyakit menular, sistem kekebalan tubuh okontrasepsi untuk menghalang halangi fertilitas, dapat dilakukan dengan pertama tama mengisolasi dan mengidentifikasi protein yang berperan dalam salah satu tahap prosedur rehasilsi untuk dipakai sebagai antigen, prosedur itu juga dinamakan modifikasi genetik, kloning gen, manipulasi gen, teknologi DNA rekombinan,
Konsep penyediaan antigen dalam pengembangan metode sistem kekebalan tubuh okontrasepsi merupakan prosedur rekayasa genetika,
Teknologi DNA rekombinan sudah dipakai untuk mempelajari prosedur rehasilsi,
baik dalam menganalisis ciri khusus hormon maupun gamet,
Sumber antigen yang sudah dikembangkan dalam metode sistem kekebalan tubuh okontrasepsi yaitu memakai salah satu molekul yang berasal dari hasilsi, fungsi dan outcome gamet,
Beberapa peptida sudah berhasil diisolasi terekspresi dalam prosedur rehasilsi dan terbukti dapat dijadikan agensia sistem kekebalan tubuh okontrasepsi , terutama pada hewan percobaan , Peptida itu adalah SP56 dan sub unit 1 dan 3 protein ZP, BMP , GDF9, GnRH, GMCSF , 27kDa HSP plasenta, LIFR, OGP, PLF atay PRL, Materi antigen yang dikembangkan sampai saat ini adalah protein GnRH dan protein ZP dengan sasaran hewan jantan, namun vaksin sistem kekebalan tubuh okontrasepsi yang memakai GnRH dan ZP tidak tidak memicu efek yang berkelanjutan,
Ekspresi gen khusus dalam uterus selama periode kritis implantasi embrio merupakan sumber antigen baru yang potensial untuk pengembangan metoda sistem kekebalan tubuh okontrasepsi, terutama pada hama spesies mamalia,
Protein yang terekspresi dalam uterus juga merupakan sumber antigen kontraseptif non hormonal , Saat ini sudah diidentifikasi faktor (berupa GF ,sitokin, kemokin ) yang berperan dalam beberapa tahap perkembangan
kehamilan pada hewan atau kehamilan pada manusia, namun belum dieskplorasi menjadi antigen dalam sistem kekebalan tubuh okontrasepsi,
Ekspresi gen penyandi beberapa molekul yang berperan dalam prosedur
implantasi di dalam jaringan uterus selalu mengalami perubahan,
Salah satu regulator dalam prosedur implantasi embrio pada mencit
adalah gen wnt, Gen wnt beraksi pada beberapa tahap perkembangan awal embrio dengan mengekspresikan protein yang berperan dalam sistem sinyal dalam sel,
Protein wnt melalui sistem sinyal selular , berperan dalam prosedur perkembangan determinasi kematian sel ,nasib sel, proliferasi, polaritas, selama
perkembangan embrio,
Sistem sinyal yang diregulasi oleh protein wnt berperan dalam implantasi , desidualisasi,perkembangan embrionik, dalam aktivasi blastokista, Eskpresi Wnt4 hanya terjadi pada implantation site, tidak ditemukan pada nonimplantation site,
Sistem sinyal wnt terjadi sepanjang perkembangan embrio sehingga memberi bukti bahwa sistem sinyal wnt memiliki peran dalam perkembangan embrio,
Teknik PCR sudah dipakai pada isolasi dan amplifikasi gen Wnt4 pada epididimis kera dan rodensia,
Gen Wnt4 sudah diidentifikasi pada manusia dan hewan percobaan , Isolasi dan deteksi ekspresi gen Wnt4 pada hewan percobaan berhasil dilakukan dengan teknik RT-PCR,
mekanisme , sumber dan fungsi aksi protein wnt4 sudah diketahui ,
amplifikasi,kloning, isolasi, deteksi eskpresi gen wnt4 berhasil dilakukan pada
hewan percobaan namun belum dikembangkan sebagai antigen dalam sistem kekebalan tubuh okontrasepsi ,
Isolasi dan kloning gen Wnt4 dengan sumber RNA berasal dari Taenia
solium pada vektor pMD18-T, kemudian ditransformasi ke dalam sel-sel kompeten , Escherichia coli DH5α sudah berhasil dilakukan, Isolasi dan amplifikasi gen Wnt4 pada Epinephelus coioides juga berhasil dilakukan,
Amplifikasi DNA insert
Amplifikasi DNA insert dilakukan dengan memakai mesin Amplitron®
dengan volume reaksi 25 µL yang terdiri dari 12,5 µL PCR mix, 2 µL primer forward, 2 µL primer reverse, 5,5 µL ddH2O, 2 µL DNA template. Kondisi PCR dilakukan dengan predenaturasi selama 5 menit pada suhu 94 ° C , denaturasi selama 1 menit pada suhu 94 ° C , annealing selama 1 menit pada suhu 57 ° C , dan
elongasi selama 1 menit pada suhu 72 ° C, Tahap elongasi diperpanjang selama 10 menit pada suhu 72 ° C . Amplifikasi DNA dilakukan sebanyak 40 siklus. kemudian tabung didinginkan pada suhu 4 ° C selama 4 menit, Hasil PCR kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1.5%. Pembuatan gel elektroforesis
dilakukan dengan menimbang 0,175 gram agarose dan dilarutkan dengan dapar TBE 25 mL dalam erlenmeyer 50 mL, dididihkan memakai autoclave dan didiamkan sampai suhu mencapai 50 ° C . Ditambahkan 1 µL DNA fluorosafe (1st Base) kemudian dihomogenkan. Cetakan gel dan sisir diatur kemudian larutan gel dituang ke dalam cetakan sampai gel mengalami polimerisasi. Chamber elektroforesis diisi dengan 1x dapar TBE. Sisir dilepaskan dari gel dan gel ditempatkan dalam chamber elektroforesis. contoh DNA dicampur dengan DNA loading dye dengan perbandingan 1: 4 (DNA loading dye: contoh DNA), diisikan pada sumuran dalam gel masing-masing sebanyak 10 µL. Sumuran
pertama dipakai untuk DNA marker (Sigma®), sumuran berikutnya dipakai
untuk DNA contoh. Gel dirunning pada 100mV selama 30 menit. Gel divisualisasi pada transluminator UV untuk mengamati band yang khusus untuk Wnt4 yaitu 400 bp.
metode isolasi RNA Wnt4
Isolasi RNA dilakukan dengan Total Isolation Kit (FTRI-25, SBS Genetech),
Implantation site pada uterus hewan percobaan yang sudah pernah dinikahkan, diisolasi pada hari ke-tujuh kehamilan. contoh uterus ditimbang sebanyak 100 mg, dimasukkan ke dalam nitrogen cair dan dihaluskan memakai mortar,
Uterus yang sudah halus ditambah 1ml redzol, dihomogenisasi kemudian disimpan pada suhu kamar selama 5 menit, Campuran redzol dan uterus ditambah dengan 0,2 ml chloroform, divortex, didiamkan 3 menit pada
suhu kamar, kemudian disentrifus selama 15 detik dengan kecepatan 12000 rpm sampai terbentuk 3 tahap. tahap atas dipindahkan ke tabung eppendorf 1.5 ml, ditambah 200 µl dan dihomogenkan. Campuran dipindah ke dalam Membran Spin Column didiamkan selama 3 menit, disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Cairan yang terkumpul di bagian bawah tabung eppendorf dibuang, membran dipindahkan ke tabung 1.5 ml dan ditambah 600 µl RNA washing buffer. Membran disentrifus ulang selama 1 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Cairan yang terbentuk dibuang, tabung disentrifus ulang,
selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Membran dipindah ke tabung 1,5 ml kemudian ditambah 50 µl DEPC, didiamkan 1-2 menit, disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Membran ditambah 30 µl DEPC, didiamkan 2 menit, disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan
12.000 rpm. Cairan yang tertampung sesudah sentrifus terakhir merupakan RNA, disimpan pada suhu -20 ° C sampai dipakai untuk RT PCR. Konsentrasi RNA ditentukan dengan rumus : [RNA]= OD260 X P X 40 µg/ml (OD: Optical Density; P:
Pengenceran: 40: Konstanta untuk RNA)
Amplifikasi gen Wnt4
Amplifikasi dilakukan dengan memakai mesin Amplitron1 dengan volume reaksi yang terdiri dari 17 µL ddH2O, 2 µL DNA template, 2µLDMSO, 2 µL PCR mix, 2 µL primer forward, 2 µL primer reverse, Kondisi optimal sintesis DNA pada saat
optimasi diperoleh pada suhu 57 ° C selama 30 menit, sintesis cDNA dilakukan selama 30 menit pada suhu 57 ° C , amplifikasi sebanyak 35 siklus dengan predenaturasi selama 5 menit pada suhu 94 ° C , setiap siklus terdiri atas denaturasi selama 1 menit pada suhu 94 ° C , annealing selama 1 menit pada suhu 57 ° C , extension selama 1 menit pada suhu 72 ° C , Tahap ekstensi diperpanjang selama 10 menit pada suhu 72 ° C. kemudian tabung didinginkan pada suhu 4 ° C selama 4 menit, Hasil PCR kemudian dielektroforesis pada gel
agarose 1.5% peninjauan dilakukan memakai transluminator UV yang
memperlihatkan band yang khusus dengan ukuran 400 bp yang siap untuk dikloning,
Tabel Primer yang dipakai pada penelitian
Primer Sekuen Tm ( °C)
Forward 5’-ACGTGCGAGAAACTCAAAGG-3’ 55,6
Reverse 5’-GGACTGTGAGAAGGCTACGC-3’ 57,8
Amplikon hasil PCR dikirim ke 1 st Base .Laboratories Singapura untuk sequencing. Program sequencing dilakukan dengan .memakai ABI PRISM 3730xL GENETIC .ANALYSER (Applied Biosystems, USA).
Algoritma hasil sequencing dianalisis dengan program BLAST. Hasil BLAST dinyatakan .dengan persentase homologi antara sekuen DNA contoh yang dianalisis dengan sekuen data base dalam NCBI (http://www. ncbi.nlm.nih.gov).
Kloning gen Wnt4
Prosedur kloning dilakukan melalui prosedur ligasi dan transformasi. prosedur ligasi untuk memperoleh DNA plasmid dengan .komposisi: 2 µL pET SUMO vektor, 1 µL T4 DNA ligase,2 µL hasil PCR, 1 µL ligation buffer dan 4 µL H2O steril. DNA plasmid diinkubasi pada suhu 12 ° C overnight,
kemudian DNA plasmid ditransformasi memakai The Champion pET SUMO
Protein Expression System,
Transformasi dilakukan dengan mengambil tabung berisi Escherichia coli BL21,
ditambahkan 5 – 10 ng DNA plasmid dengan memakai pipette tip, kemudian
diinkubasi dalam es selama 30 menit. Tabung berisi Escherichia coli dan DNA plasmid kemudian diberi kejutan panas (heat shock) dengan menempatkan tabung pada suhu 42 ° C selama 30 detik yang kemudian segera disimpan ke dalam tabung es. Ditambahkan 250 µL SOC medium, tabung ditutup dengan erat dan
diinkubasi dalam waterbath selama 1 jam pada suhu 37 ° C dengan kecepatan 200 rpm. Hasil reaksi transformasi disimpan pada suhu 2 ° C, dan siap untuk dikultur pada media LB padat. Hasil transformasi dinamakan transforman,
Kloning gen Wnt4
Kloning sekuen gen Wnt4 memakai pET SUMO sebagai vektor pengekspresi dan Escherichia coli BL21 sebagai sel kompeten berhasil dilakukan. Sekuen gen Wnt4 hasil amplifikasi diligasi pada plasmid sehingga terbantuk plasmid rekombinan.
Plasmid rekombinan kemudian ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21. Escherichia coli pembawa plasmid rekombinan ditumbuhkan pada media LB padat yang sudah diberi antibiotik kanamycin dengan konsentrasi 1:1000. Kultur Escherichia coli pada media LB padat dilakukan selama satu malam pada suhu 37 ° C dalam waterbath.
Hasil kultur Escherichia coli pembawa plasmid rekombinan menampakkan 13 koloni putih yang tumbuh, Hasil transformasi plasmid rekombinan ke dalam Escherichia coli BL21. Keterangan: Angka menampakkan jumlah klon yang tumbuh pada
media LB padat Koloni putih hasil transformasi ditumbuhkan dalam 5 ml media LB cair, pada waterbath pada suhu 37 ° C dengan kecepatan 120 rpm. Isolasi DNA plasmid rekombinan dilakukan sesudah E.coli pembawa DNA rekombinan diinkubasi selama 1 malam. Hasil isolasi DNA plasmid rekombinan di-running
pada gel agarosa 1.5% dan divisualisasikan pada transluminator ultraviolet, Hasil visualisasi menampakkan DNA plasmid rekombinan berhasil diisolasi dari semua contoh E.coli transforman (nomor contoh 1 sampai 13).
Deoxyribo nucleic acid (DNA) plasmid rekombinan diamplifikasi dengan PCR pada suhu annealing 57 ° C memakai primer yang sama dengan amplifikasi gen Wnt4 dengan RT-PCR. Running DNA dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa 1.5% dengan volume loading contoh sebanyak 10µl dan divisualisasikan pada iluminator ultraviolet. Hasil visualisasi menampakkan
fragmen DNA hasil PCR berhasil insert pada DNA plasmid, diperlihatkan dengan band.dengan ukuran 400bp, Hasil DNA insert dengan ukuran 400bp
diperlihatkan pada klon no 1,2,3,4,5,6,11,12,13 (kotak merah)
Analisa DNA insert
Hasil transformasi ditumbuhkan pada media LB padat dengan cara meratakan koloni pada media LB padat yang sudah diberi kanamycin dengan konsentrasi 1:1000 (kanamisin:media LB) dalam cawan petri. LB padat yang sudah ditanami dengan transforman, diinkubasi pada suhu 37 ° C dalam waterbath selama 1 malam,lakukan pemantauan pada koloni transforman pada media LB
padat, Koloni putih yang tunggal pada media LB pada diisolasi dan dipindahkan pada tabung yang berisi 5 mL media LB cair, diinkubasi selama 1 malam pada waterbath pada suhu 37 ° C, dengan kecepatan 120 rpm. DNA yang berhasil insert pada plasmid dideteksi dengan cara mengisolasi DNA plasmid dari masing masing klon, kemudian diamplifikasi dengan teknik PCR memakai primer yang sama seperti yang dipakai dalam amplifikasi gen Wnt4,
Isolasi DNA plasmid
Satu koloni dari media LB dipindahkan ke dalam media LB cair, diinkubasi dan dishaker dengan kecepatan 40 rpm selama 24 jam pada suhu 37 ° C . Kultur bakteri pada media LB cair dipindahkan ke dalam tabung microsentrifuge,
kemudian disentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 1 menit, Supernatan yang .terbentuk dibuang, kemudian 200 µL buffer PD1 yang sudah ditambahkan RNAse A ditambahkan pada tabung mikrosentrifuge dan pellet disuspensikan dengan memakai vortex. dapar PD2 sebanyak 200 µL ditambahkan pada tabung dan dicampur .dengan cara membolak-balik tabung sebanyak 10 kali, Dapar PDS 300 µL dipipet dan dicampurkan kemudian dibolak-balik 10 kali, disentrifugasi 14.000 rpm selama 3 menit. Supernatan yang terbentuk sesudah sentrifus dipindahkan ke PD column dari microtube, diulangi sentrifus dengan kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik. Bagian bawah PD column dibuang, PD column
kembali ditempatkan pada collection tube 2 mL. Wash buffer yang sudah dicampur ethanol dipipet sebanyak 600 µl ditambahkan pada PD column kemudian sentrifuge dengan kecepatan 14.000 rpm selama 30 detik. Bagian bawah PD column dibuang dan diletakkan kembali pada 2 mL collection tube, disentrifugasi 14.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan matrix column. DNA yang berhasil diisolasi disimpan pada suhu -20 ° C,
Amplifikasi dan Sekuensing Gen Wnt4 Isolasi total RNA dengan Total Isolation
Kit (FTRI-25, SBS Genetech), sintesis cDNA dengan reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) dan amplifikasi gen Wnt4 dengan memakai primer forward 5’-ACGTGCGAGAAACTCAAAGG-3’ dan reverse 5’-GGACTGTGAGAAGGCTACGC-3’ berhasil dilakukan, Hasil BLAST sekuen primer yang dipakai pada data base dalam NCBI menampakkan hasil bahwa primer
itu merupakan primer yang tepat untuk amplifikasi gen Wnt4 sehingga dapat
menempel pada sekuen nukleotida gen wnt4 ,
Hasil amplifikasi gen Wnt4 dan hasil elektroforesis pada gel agarosa 1,5%
menampakkan bahwa gen Wnt4 mencit strain Swiss Webster berhasil diamplifikasi memakai primer yang dipakai Hayashi , sehingga memicu
munculnya band dengan ukuran 400 bp (hasil tidak ada). Hasil sekuensing dengan primer forward menampakkan panjang nukleotida 393 bp sedang memakai primer reverse menampakkan 394 bp. Hasil BLAST pita ukuran 400 bp menampakkan bahwa sekuen itu merupakan sekuen gen Wnt4 M.musculus L. Sekuen gen Wnt4 diperlihatkan dengan persentase homologi antara sekuen DNA contoh yang dianalisa dengan sekuen database dalam NCBI (NM_009523.2), yang menampakkan urutan nukelotida 99% dengan Mus musculus wingless-related MMTV integration site member 4.
Primer yang dipakai dalam penelitian ini dapat mengamplifikasi sekuen
nukleotida gen Wnt4, diperlihatkan dengan band yang berukuran 400 bp (hasil tidak ada), Pemilihan dan pemakaian primer pada RT-PCR sudah dirancang agar
dapat melekat pada sekuen nukleotida yang diharapkan sehingga gen target dapat teramplifikasi sempurna. area penempelan .primer terletak pada urutan pasangan basa ke-169 sampai ke-550 sehingga panjang sekuen yang teramplifikasi adalah 381 pasangan basa, itu sesuai dengan penelitian Hayashi
Primer harus mengapit urutan sekuen target, sehingga urutan sekuen yang akan
diamplifikasi dapat diperoleh dengan tepat, Ketepatan penempelan primer merupakan salah satu faktor penentu kesuksesan amplifikasi sekuen DNA,
Hasil optimasi pada penelitian ini menampakkan gen dapat teramplifikasi dengan
kondisi optimum pada suhu annealing 57 ° C ,
penelitian Hayashi dengan suhu annealing 55 ° C menghasilkan 381 bp29, sedang dengan suhu annealing 60 ° C dan menghasilkan 344 bp28,
bahwa perbedaan suhu annealing dalam penelitian ini kemungkinan menjadi
penyebab primer dapat mengamplifikasi dua gen secara bersamaan. Perbedaan suhu annealing pada penelitian ini menandakan bahwa hasil amplifikasi adalah gen Wnt4 dengan ukuran 400 bp. itu ditunjukkan dengan urutan nukelotida 99% dengan Mus musculus wingless-related MMTV integration site
member 4 pada hasil BLAST sekuen nukleotida gen Wnt4 yang diperoleh
(NM_009523.2).
Plasmid merupakan vektor pengekspresi yang paling umum dipakai dalam prosedur kloning gen. Plasmid yang saat ini dipakai sebagai vektor kloning adalah pET yang mampu menghasilkan 60 salinan dalam tiap sel. Plasmid ini juga memiliki replikon, suatu daerah pada DNA plasmid yang terdiri dari origin of replication dan cis-acting control elements. Replikon menentukan jumlah salinan
DNA yang dapat dilakukan oleh plasmid,
Plasmid pET memiliki elemen penting untuk eskpresi gen, yaitu lacI gene,
sebuah promoter T7 yang khusus untuk T7 RNA polymerase dan lac operator yang dapat menahan transkripsi, sebuah ampicillin resistance gene, dan dua daerah origin of replication (ori) yaitu f1 yang dalam kondisi tertentu dapat menghasilkan vektor untai tunggal, dan area origin of replication yang
konvensional,
Plasmid pET SUMO pada penelitian ini memiliki nukleotida 5643 sehingga hasil
insersi hasil PCR membentuk DNA .rekombinan dengan ukuran ± 6036-6037 bp.
Pembentukan DNA rekombinan dapat terjadi karena pET SUMO memiliki cloning site pada basa 653-654, Insersi hasil PCR membentuk DNA plasmid
rekombinan pada pET SUMO dapat terjadi karena Taq polymerase memiliki aktivitas nontemplate-dependent yang menambahkan deoxyadenosine tunggal (A) pada ujung 3´ hasil PCR. Sebaliknya, vektor pET memiliki residu deoxythymidine yang memungkinkan hasil PCR insert dan ligasi secara efisien ke
dalam vektor,
menampakkan efektifitas insersi hasil PCR ke dalam plasmid yang tinggi yaitu sekitar 70% (sembilan dari 13 koloni). Tahap kemudian dalam kloning gen
adalah prosedur transformasi. prosedur ini merupakan prosedur memindahkan plasmid rekombinan ke dalam sel inang. prosedur transformasi dilakukan dengan menambahkan larutan CaCl atau ‘heat shocking’ sehingga DNA asing dapat masuk ke dalam sel bakteri sebagai sel kompeten,
prosedur transformasi pada penelitian ini dilakukan dengan kejutan panas (heat
shocking), dengan cara memindahkan campuran plasmid dan sel kompeten Escherichia coli
BL21 dari suhu rendah (es) ke suhu 42° C kemudian kembali ke suhu rendah (tabung es). Heat shocking memicu stabilitas membran sel bakteri terganggu sehingga memungkinkan DNA plasmid yang beragregasi dengan Ca2+ dipermukaan sel, menembus membran dan masuk ke dalam sel,
Rehasilsi sekuen DNA yang dicari/diklon dapat dilakukan dengan mengkultur bakteri pembawa plasmid rekombinan, Kultur Escherichia coli yang dipakai untuk kloning dan ekspresi protein rekombinan dilakukan dengan tryptonephosphate yang mengandung antibiotik tertentu, Pemberian antibiotik dilakukan untuk screening kesuksesan rekombinasi dan .transformasi DNA, Antibiotik yang diberikan pada penelitian adalah kanamycin. Plasmid pET SUMO merupakan plasmid yang
memiliki gen yang kebal terhadap kanamycin pada uruttan basa 1431-2246,
sehingga pemberian kanamycin dalam penelitian ini sebagai screening kesuksesan rekombinasi DNA sudah tepat dilakukan. Hasil dari interaksi kanamycin dalam media LB dengan gen yang kebal terhadap kanamycin
pada plasmid ditunjukkan oleh keberadaan 13 klon yang mampu tumbuh pada media LB padat dengan penambahan kanamycin , adalah klon yang mengandung
DNA plasmid, Escherichia coli merupakan mikrobia .yang dipakai untuk manipulasi , DNA sebagai vektor pengekspresi protein rekombinan, pemakaian.Escherichia coli dilakukan karena kemudahannya untuk dikultur dan berkembang dalam medium yang sederhana,
Escherichia coli sebagai vektor juga sudah dipakai untuk mengekspresikan ZP1 dari Macaca radiate, ZP3 dan ZP257, protein rekombinan bmZP1 (132–147 aa), bmZP2 (86–113 aa) dan bmZP3 (324–347aa),
Escherichia coli BL21 dan derivatnya merupakan strain Escherichia coli yang baik untuk ekspresi protein rekombinan,
Escherichia coli memiliki siklus hidup yang pendek karena mampu
membelah dalam waktu 20 menit ,
data mengenai gen dalam Escherichia coli juga lengkap dapat dilakukan rekayasa dengan banyak teknik ,
peneliti sudah memakai Escherichia coli sebagai inang pada kloning gen dalam penyediaan antigen untuk sistem kekebalan tubuh okontrasepsi untuk memperoleh protein rekombinan hasil konjugasi empat atau enam moieties LHRH pada ovalbumin,
.
KLONING GEN PENYANDI AG85A MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS
Mycobacterium tuberculosis, agen pemicu Tuberkulosis (Tuberkulosis)
Beberapa strategi pengendalian Tuberkulosis termasuk pemakaian vaksin Program Directly Observed Treatment Shortcourse (DOTS) dan pemakaian vaksin BCG , DOTS jangka pendek dapat mengurangi beban Tuberkulosis global sebesar 50% dalam waktu 10 tahunBCG melindungi anak-anak dari Tuberkulosis namun tidak efisien dan konsisten melindungi orang dewasa ,yaitu Tuberkulosis paru perlindungan 0% sampai 80%, BCG tidak memberi perlindungan dari pembentukan Tuberkulosis laten dan reaktivasi berikutnya,
Para peneliti telah mengurutkan genom lengkap dari Mycobacterium tuberculosis,
Protein ekskretori dan protein permukaan dinding sel yang terpajan adalah antigen besar yang dikenali oleh sistem kekebalan terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium bovis. Pada penelitian dengan tikus dan kelinci percobaan menampakkan kekebalanisasi dengan seluruh filtrat kultur, sumber kaya protein ekstraseluler dapat melindungi hewan coba sampai batas tertentu terhadap infeksi berikutnya dengan basil tuberkel,
Sebuah fraksi utama dari protein ekskretori ,filtrat kultur Mycobacterium tuberculosis dan Mycobacterium bovis BCG adalah kompleks Ag85. Protein antigen 85 (Ag85) yang disekresikan ada pada permukaan dinding sel MycobacteriuMycobacterium Ekspresi Ag85 diperlukan untuk kelangsungan hidup Mycobacterium tuberculosis dalam makrofag dan dianggap sebagai faktor virulensi. Tiga anggota protein Ag85 dengan 30-32 kD (Ag85C,Ag85A,
Ag85B ), yang masing-masing memiliki aktivitas enzimatik mycolyltransferase yang diperlukan untuk biogenesis faktor penghubung (trehalosa-dymycolate).
Protein yang dikodekan oleh tiga gen paralogous (fbpC,fbpA, fbpB ) terletak di
area yang berbeda dari genom bakteri. Kebanyakan studi kekebalanologi telah difokuskan pada Ag85B dan Ag85A sedikit yang diketahui tentang anggota ketiga protein ini, Ag85C7 Kedua protein Ag85A dan Ag85B adalah
calon yang menjanjikan untuk vaksin tuberkulosis di masa depan.
Banyak penelitian pada hewan model menampakkan bahwa vaksinasi dengan
rekombinan DNA Ag85A atau protein Ag85A dapat menginduksi respon kekebalan yang kuat dengan sekresi sitokin Th1 yang signifikan (IL-2 dan IFN-γ) yang penting dalam mengatur beberapa sel-sel kekebalan dan menginduksi sel
sitotoksik,
Antigen 85A (Ag85A) Mycobacterium, yang dikodekan pada fibronectin binding
protein-A (fbp-A) dengan 1014 bp dan berat molekul 32 kD, merupakan salah satu protein yang disekresikan oleh Mycobacterium bovis dan Mycobacterium tuberculosis , Protein Ag85A menginduksi proliferasi sel T yang kuat dan produksi IFN-γ di sebagian besar orang sehat yang terinfeksi Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae dan tikus yang divaksinasi BCG, tapi tidak pada pasien
Tuberkulosis atau kusta lepromatosa. Gangguan gen encoding Ag85A pada Mycobacterium tuberculosis, fbpA, menghasilkan strain yang gagal untuk
memanipulasi makrofag manusia atau tikus menampakkan bahwa Ag85A mungkin berperan terhadap patogenesis Mycobacterium tuberculosis,
beberapa protein ekskretori Mycobacterium tuberculosis berperan penting terhadap patogenesis penyakit dan imunostimulan yang secara langsung
berinteraksi dengan sistem kekebalan host yang menampakkan janji besar sebagai potensi target vaksin, termasuk Ag85A dan Ag85B yang sering dipakai sebagai antigen dalam vaksin Tuberkulosis saat ini dalam uji klinis. Keduanya terutama diekspresikan selama tahap awal infeksi, yang mana Mycobacterium tuberculosis membagi dengan cepat dan berperan dalam sintesis dan perakitan
komponen dinding sel,Bila tingkat pertumbuhan menurun, maka sintesis mycolyl
transferase kurang dibutuhkan dan ekspresi protein Ag85A akan berkurang. Oleh karena itu, dilakukan langkah untuk menuju identifikasi target vaksin yang memiliki profil ekspresi yang lebih konstitutif dan kemudian dilakukan uji
efektivitas perlindungan dari vaksin Tuberkulosis.
dengan pemakaian protein rekombinan untuk memproduksi protein Ag85A dalam skala besar. Protein rekombinan adalah suatu protein yang dikode oleh urutan DNA yang telah mengalami rekombinasi dan dinamakan rekombinasi DNA. Rekombinasi DNA adalah penggabungan segmen-segmen DNA target dengan DNA vektor, yaitu plasmid yang ada di dalam bakteri dengan jumlah yang
besar,
Alasan pemakaian protein rekombinan karena produksi protein rekombinan dapat
dibuat dalam skala besar dengan waktu yang singkat karena produksi protein dibantu oleh bakteri sehingga dapat dipakai untuk uji imunkgenisitas sebagai evaluasi vaksin, Produksi Ag85A yang dilakukan dengan teknologi rekombinan memakai bantuan bakteri Escherichia coli sebagai inang.
Teknologi rekombinan dapat dilakukan melalui tahap amplifikasi, kloning, dan ekspresi molekuler. Amplifikasi Ag85A adalah salah satu prosedur yang menentukan keberhasilan pembuatan protein rekombinan, Amplifikasi Ag85A bertujuan untuk memperbanyak fragmen DNA yang dilakukan secara in vitro dengan metode PCR dan memakai primer khusus Ag85A sehingga reaksi penggandaan DNA terjadi pada target DNA yang diinginkan, Fragmen DNA yang mengandung gen target yang berhasil diamplifikasi dilakukan penyisipan ke dalam vektor yang berperan sebagai pembawa gen yang akan dikloning ke
dalam sel inang. peneliti melakukan amplifikasi gen penyandi Ag85A dengan memakai desain primer khusus yang dirancang sendiri dari genom strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv, dan kloning gen penyandi Ag85A Mycobacterium tuberculosis dengan memakai vektor pET SUMO dan ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21
Amplifikasi gen Ag85A Gen Ag85A diamplifikasi dengan PCR memakai primer khusus yang didesain dari genom strain Mycobacterium tuberculosis
H37Rv dengan primer reverse 3'GTTTCCTAAATCCCGTCCCTAGCT5' dan primer forward 5'TGGATGCGTTGAGATGAGGATGAG3' yang menghasilkan 1017 bp fragmen. Amplifikasi dilakukan dengan tahap pre-denaturasi 94 ° C
selama 3 menit, 35 siklus amplifikasi (denaturasi 94°C selama 1 menit, anneling 54°C selama 1 menit, elongasi 72°C selama 1 menit), dan elongasi akhir pada suhu 72 °C selama 10 menit,
Deteksi Produk PCR dan Sekuensing
Produk PCR hasil amplifikasi dianalisis dengan elektroforesis memakai gel agarose 2% yang dilarutkan dalam 1,0 X TuberkulosisE (Trisborat-EDTA). Hasil elektroforesis berupa pita DNA diamati di bawah sinar UV. Sekuensing
dilakukan di laboratorium . Kloning Ag85A Prosedur kloning terdiri dari ligasi dan
transformasi. Proses ligasi dilakukan berdasar Champion™ pET SUMO Protein
Expression System, Invitrogen kits. Ligasi dilakukan dengan membuat Plasmid DNA di dalam tube dengan komposisi 2 µL Produk PCR fresh, 1 µL 10x Ligation Buffer , 2 µL pET Sumo Vektor, 4 µL Steril Water, dan 1 µL T4 DNA LigasEscherichia Hasil ligasi diinkubasi 15 °C ,selama minimal 4 jam (12°C/overnight). Simpan
ligasi pada suhu -20,° C sampai siap untuk transformasi.
Transformasi dilakukan memakai Escherichia coli BL21 sebagai sel inang untuk
mengekspresikan DNA rekombinan menjadi protein karena adanya T7 RNA polimerase yang akan dikenali oleh promoter T7 vektor ekspresi pET. Transformasi yang dilakukan berdasar Champion™ pET SUMO Protein Expression
System, Invitrogen kits, Escherichia coli BL21 ditambahkan dengan plasmid DNA dan SOC medium melalui proses tertentu dan diinkubasi ,37 °,C selama 1 jam dengan shaker. Hasil ,transformasi ditambahkan pada 10 mL medium
LB padat yang telah mengandung 50 μg/ml ,kanamisin pada cawan petri, kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 24 jam,
Gen Ag85A diamplifikasi dengan metode PCR memakai primer khusus Ag85A yang didesain memakai genom strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Hasil
amplifikasi divisualisasikan melalui elektroforesis gel agarosa 2% .Hasil visualisasi amplifikasi gen penyandi Ag85A dari genom strain Mycobacterium tuberculosis H37Rv dengan elektroforesis gel agarosa 2% menampakkan fragmen DNA dari kedua contoh berukuran 1017 bp. fragmen DNA yang berukuran 1017 bp dilakukan sekuensing untuk mengkonfirmasi gen penyandi
Ag85A, dan memperlihatkan hasil sekuensing ,
Hasil ligasi antara DNA Ag85A insert ke vektor pET SUMO ditransformasikan ke dalam Escherichia coli BL21 sebagai sel inang. Hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media Luria Bertani (LB) padat dengan penambahan
kanamisin 50 μg/ml sebanyak empat koloni ,
4 koloni bakteri yang diperoleh dilakukan isolasi DNA Plasmid untuk
mengidentifikasi gen Ag85A insert ke vektor pET SUMO, Hasil isolasi DNA plasmid divisualisasikan dengan elektroforesis gel
agarosa 2% ,
Hasil isolasi DNA plasmid dilakukan amplifikasi untuk mengidentifikasi gen insert
dengan memakai primer khusus Ag85A. Hasil amplifikasi divisualisasikan melalui
elektroforesis gel agarosa 2% ,Hasil amplifikasi gen Ag85A dari DNA
plasmid menampakkan bahwa dua koloni bakteri memberi hasil positif membawa gen Ag85A,
penelitian tahun 2000 melakukan kloning dan ekspresi Ag85B dan Ag85A ,dengan memakai vektor pTrcHisB dan Escherichia coli TOP10 sebagai
ekspresi host untuk ekspresi protein rekombinan, bahwa pTrcHisB vektor mengatasi masalah persentase G+C rendah di genom Escherichia coli.
penelitian pada tahun 2002
melakukan kloning dan ekspresi kekebalanodominan Ag85A ke plasmid PBK-CMV yang rekombinannya ditransformasikan ke dalam Escherichia coli XL-1 blue MRF dan IPTG dipakai sebagai inducer untuk ekspresi dari protein. Hasil ekspresi protein yang diperoleh stabil dengan berat molekul 32 kDa yang
dikarakterisasi dengan memakai SDS PAGE dan Western blotting.
bahwa kloning dan ekspresi gen penyandi Ag85A Mycobacterium tuberculosis telah berhasil dilakukan dengan hasil kloning dan ekspresi protein yang stabil dan diproduksi dalam skala besar. hasil yang memperlihatkan kloning dan ekspresi gen penyandi Ag85A pada vektor yang berbeda-beda.
Koloni bakteri yang diperoleh dilakukan isolasi DNA plasmid dan hasil isolasi DNA plasmid divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarose 2%. Vektor pET SUMO memiliki ukuran 5643 bp dan DNA Ag85A sisipan memiliki ukuran nukleotida 1017 bp, sehingga menghasilkan vektor rekombinan berukuran
6660 bp yang terlihat pada hasil isolasi DNA plasmid yang divisualisasikan dengan elektroforesis gel agarose 2%. Uji tapis dilakukan pada hasil isolasi DNA plasmid bakteri dengan metode PCR untuk mengidentifikasi koloni bakteri yang membawa gen insert. Hasil uji tapis dari empat koloni bakteri Escherichia coli BL21 ditemukan dua koloni bakteri yang positif membawa gen Ag85A. Gen
insert ditunjukkan dari hasil isolasi plasmid koloni bakteri Escherichia coli BL21 yang diamplifikasi dengan primer khusus Ag85A menampakkan band khusus dengan ukuran nukleotida 1017 bp.
Pada penelitian ini, metode kloning dilakukan untuk memasukkan produk PCR hasil .amplifikasi gen penyandi Ag85A Mycobacterium tuberculosis ke vektor pET SUMO berdasar protokol Champion™ pET SUMO Protein .Expression System, Invitrogen kits. Pemotongan gen sisipan atau plasmid pada proses ligasi tidak
perlu dilakukan pada metode kloning ini. Vektor pET SUMO memiliki desain yang
mempermudah satu tahap strategi kloning yaitu dengan penyisipan langsung produk PCR ke dalam vektor. Taq polimerase dari produk PCR memiliki aktivitas non template dependent yang menambahkan deoxyadenosine (A) tunggal ke
ujung 3’. Desain vektor pET SUMO yang dipakai memiliki residu 3’ deoxythymidine
(T) tunggal yang dapat berikatan dengan deoxyadenosine (A) tunggal dari produk PCR sehingga memungkinkan penyisipan produk PCR untuk efisiensi ligasi ke vektor. Gen penyandi Ag85A berhasil disisipkan ke dalam vektor pET SUMO dan dapat ditransformasi ke dalam Escherichia coli BL21. Transformasi ke dalam Escherichia coli BL21 bertujuan untuk memperbanyak dan pemeliharaan plasmid rekombinan dengan stabil. Hasil transformasi yang ditumbuhkan pada media Luria Bertani (LB) padat dengan penambahan kanamisin 50 μg/ml diperoleh
empat koloni bakteri. Koloni bakteri Escherichia coli BL21 yang tumbuh pada media seleksi dengan kanamisin disebabkan oleh bakteri Escherichia coli BL21
membawa vektor pET SUMO. Vektor pET SUMO memiliki gen penanda resisten terhadap kanamisin sehingga bakteri dapat tumbuh.
Gen penyandi Ag85A Mycobacterium tuberculosis diamplifikasi dengan memakai primer .khusus Ag85A yang dirancang dari genom Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv. Genom Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv telah dimanfaatkan untuk amplifikasi gen Ag85A memakai primer khusus Ag85A dengan metode PCR, hasil amplifikasi gen penyandi Ag85A Mycobacterium
tuberculosis diperoleh band khusus dengan ukuran nukleotida 1017 bp dan hasil sekuensing untuk mengkonfirmasi gen penyandi Ag85A, menampakkan fragmen DNA berukuran 1017 bp. Amplifikasi dan sekuensing gen penyandi
Ag85A Mycobacterium tuberculosis telah dilakukan peneliti yang memperoleh fragmen DNA Ag85A berukuran 1017 bp dan menampakkan hasil yang
sama pada penelitian ini.
KLONING GEN PENYANDI ANTIGEN HBSAG100 UNTUK PRODUKSI PROTEIN REKOMBINAN SEBAGAI MODEL IMUNOGEN UNTUK MENGHASILKAN ANTIBODI ,
kloning merupakan metode baru rekayasa genetika tentang pengembangbiakan suatu mahluk hidup yang persis sama dengan induknya tanpa melalui pembuahan, seperti stek pada tanaman, proses penggandaan jumlah DNA rekombinan melalui proses perkembangbiakan sel bakteri (biasanya E. coli). Proses penggandaan itu dilakukan dengan memasukkan DNA rekombinan ke dalam E.coli, diikuti dengan inkubasi sel E.coli pada suhu optimal sehingga sel berkembangbiak secara eksponensial, menggandakan jumlah molekul DNA tidak hanya dapat dilakukan dengan memanfaatkan mekanisme kehidupan mikroorganisma, namun dapat juga dilakukan melalui teknik PCR (Polymerase Chain Reaction),
rekayasa terhadap gen penyandi antigen permukaan hepatitis B untuk menghasilkan antigen HBsAg pada E. coli dengan memakai teknologi rekombinan. Kendala produksi antigen itu pada bakteri E. coli adalah tingkat ekspresinya sangat rendah , disebabkan oleh bagian hidrofobik , Oleh sebab itu, pada penelitian ini bagian yang dikloning adalah bagian penyandi epitop yang bersifat hidrofilik (dari asam amino 100-164), gen penyandi antigen permukaan hepatitis B di atas akan digabung dengan gen penyandi enzim gluthation-S-transferase (GST) untuk meningkatkan solubilitas maupun ekspresi solubilitas antigen yang penting untuk aktivitas proses purifikasi , Gen penyandi
antigen permukaan hepatitis B yang dipakai pada penelitian ini adalah gen
yang diisolasi dari virus hepatitis B sub tipe adw sebagai subtype di negara asia tenggara, untuk membuat calon vaksin galur lokal yang mampu
memberikan tanggapan antibodi khusus sesuai dengan genetik virus hepatitis B yang ada di negara asia tenggara,
Dihasilkannya calon vaksin hepatitis B rekombinan dengan teknologi rekayasa DNA memakai bakteri ini menggantikan metode produksi vaksin konvensional dari plasma yang memiliki kelemahan seperti kekhawatiran adanya kontaminasi penyakit lain pada serum donor, sumber plasma yang terus berkurang (karena jumlah penderita penyakit hepatitis B menurun sejalan dengan keberhasilan vaksinasi),rendahnya imunogenisitas, oleh Karena gen penyandi antigen
itu diisolasi dari virus hepatitis B yang ada negara asia tenggara , maka antigen ini diharapkan dapat menghasilkan calon vaksin rekombinan hepatitis B yang sesuai dengan genetik virus di negara asia tenggara ,
Untuk mengamplifikasi fragmen S (asam amino nomor 100-164) dari gen
penyandi antigen permukaan virus hepatitis B, dipakai plasmid pGET-HB , yang membawa gen-gen permukaan virus hepatitis B sebagai cetakan,
Untuk amplifikasi itu, dipakai primer HBVS.100(f)
(5'-TATCAAGGTATGTTGCCCGTTTG -� 3' dan HBVADWS (r) ��(5'AAGCTTCATTACTCCCATAGGTATTTTGCGAAAG-�3')��
enzim DNA polimerase yang dipakai adalah enzim pyrobest, Fragmen itu kemudian diligasi dengan teknik Kloning TA memakai vektor pGEX-4T-2 (Pharmacia). Plasmid rekombinan itu kemudian ditransformasi ke bakteri E. coli '+DH5a,kultur bakteri dilakukan pada media Luria Bertani, sedang isolasi plasmid untuk sekuensing dipakai Kit Nucleospin ,
Amplifikasi gen penyandi HBsAg100
Campuran PCR yang dipakai adalah 0,1 unit enzim DNA polymerase
pyrobest dengan bufernya; 0,5 �M primer forward (f) dan reverse (r); 0,2 mM dNTP; 1 ng/ml , plasmid pGEMT-HB sebagai cetakan,
Program PCR yang dipakai adalah denaturasi awal pada suhu 94oC selama 5
menit ; siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94 ° C selama 30 detik, annealing pada suhu 54 ° C selama 30 detik dan elongasi (ekstensi) pada suhu 72 ° C selama 30 detik; diakhiri dengan 72 ° C selama 5 menit dan 20 ° C sampai contoh diangkat untuk dielektroforesis,
Konstruksi plasmid rekombinan
Hasil PCR kemudian dimurnikan dengan DNA Gel extraction kit dan diligasi
dengan plasmid pGEX-4T-2 (Pharmacia) yang telah dipotong dengan enzim Sma1.
Campuran reaksi dari ligasi itu adalah produk PCR 2 �l, 25 ng/�l pGEX-4T-2, 1 �l
kit ligasi, dilanjutkan dengan inkubasi pada suhu 12 ° C selama 18 jam. sesudah itu, transformasi dilakukan dengan E. coli DH5D untuk kemudian ditumbuhkan pada media LB yang mengandung ampicilin pada suhu 37 ° C selama 14 jam. Koloni bakteri yang tumbuh kemungkinan memiliki plasmid rekombinan. Untuk memastikan hal itu, dilakukan skrining koloni yang membawa plasmid itu dengan teknik PCR koloni, Transformasi, skrining dan sekuensing
Skrining terhadap koloni E. coli DH5. yang membawa plasmid rekombinan
dilakukan dengan PCR koloni dengan campuran reaksi sebagai berikut: 0,2 mM
dNTP; 0,5 U Ex Taq dan bufernya; 0,5 mM primer pGEX-�5' dan pGEX -3' , 1 p ÷{ 1
contoh (koloni yang telah diencerkan dalam 20 �p1 air steril). dibuat replika dari koloni bakteri yang diskrining pada media LB yang mengandung ampicilin dan ditumbuhkan pada suhu 37 ° C, Program PCR yang dipakai adalah 5
menit pada 94 ° C , 25 siklus untuk suhu 94° C selama 30 detik, 60 ° C selama 30 detik dan 30 detik pada suhu 72 ° C, diakhiri dengan 72 ° C selama 5 menit dan 20 ° C sampai contoh diangkat untuk dielektroforesis.
Adanya pita DNA dari gambar hasil elektroforesis sebagai tanda bahwa
klon yang diamplifikasi mengandung plasmid rekombinan. Koloni yang mengandung plasmid rekombinan itu pada replika kemudian dikultur pada media LB pada suhu 37 ° C selama 12 jam dengan goyangan untuk isolasi plasmid rekombinan. Isolasi plasmid dilakukan dengan teknik standar , Sekuensing
dilakukan setelah amplifikasi dengan Kit Bigdye , dengan memakai primer pGEX-�5' , Sekuensing itu dimaksudkan untuk memastikan bahwa pada gen target tidak ada mutasi,
Selubung virus hepatitis B (hepatitis B virus envelope) terdiri dari membran
glikoprotein dimana terdapat 3 bagian protein permukaan yaitu antigen S (226 asam amino) , pre-S1 (119 asam amino) dan pre-S2 (55 asam aminio) ,
Beberapa ahli menggolongkan ketiga protein itu sebagai protein kecil
,sedang dan besar , Antigen S telah dipakai secara luas sampai saat ini sebagai vaksin konvensional, asam amino ke 139-147 pada bagian S merupakan epitop
utama pada protein S itu. sedang asam amino Pre-S1 dan Pre-S2 masih diteliti
tingkat immunogenisitasnya ,
asam amino ke 139-147 pada protein bagian S merupakan epitop utama pada protein, maka pada penelitian ini dilakukan amplifikasi hanya dari asam amino ke-100 sampai 164, jumlah nukleotidanya mencapai 195 pasang basa, namun dengan penambahan adaptor yang sengaja dibuat memicu total produk PCR target mencapai 206 pasang basa, bagian asam amino itu dipilih karena merupakan protein yang bersifat hidrophilik, memudahkan ekspresi pada bakteri.
Untuk memperoleh gen itu, langkah optimalisasi reaksi amplifikasi dengan
mengatur konsentrasi DNA sebagai cetakan dan primer, mengatur konsentrasi enzim polymerase DNA,mengatur konsentrasi enzim polymerase DNA, suhu dan waktu annealing,
Campuran PCR yang berhasil dipakai untuk mendapat hasil PCR yang optimal adalah 0,1 unit enzim DNA polymerase pyrobest dengan bufernya; 0,5 �M primer
forward (f) dan backward (b); 0,2 mM dNTP; 1 ng/ml plasmid pGEMT-HB sebagai
cetakan. pemakaian DNA dengan konsentrasi kurang dari 1 ng/ml menghasilkan
pita gen target yang tidak jelas. pemakaian DNA melebihi 1 ng/ml memicu munculnya beberapa pita produk PCR yang tidak sesuai dengan ukuran pita target. Program PCR yang berhasil dipakai adalah 94 °C selama 5
menit, 25 siklus pada 94 °C selama 30 detik, 54 °C selama 30 detik dan 72 °C selama 30 detik, diakhiri dengan 72 °C selama 5 menit dan 20oC sampai contoh diangkat untuk dielektroforesis. Untuk menemukan suhu annealing yang ideal (54 °C ), telah dilakukan PCR memakai beberapa suhu annealing
mulai dari 50 °C , 52 °C , dan 56 °C ,Namun pita gen target terjelas didapat pada saat memakai suhu 54 °C , Ketepatan suhu dan waktu annealing, konsentrasi DNA dan primer dan konsentrasi enzim polymerase DNA yang dipakai menentukan keberhasilan amplifikasi. pemakaian suhu annealing
54 °C selama 30 detik memicu primer-primer yang dipakai menempel pada area khusus dari DNA cetakan, waktu yang diperlukan untuk tahap extention selama 30 detik pada suhu 72 °C karena enzim polymerase Pyrobest yang dipakai memerlukan waktu 1 menit per 1 kilo pasang basa, Berbeda dengan enzim polymerase Ex Taq yang biasanya memiliki kemampuan lebih cepat, yaitu 40 detik per 1 kilo pasang basa. Hal ini disebabkan enzim polymerase Pyrobest merupakan enzim dengan tingkat kecermatan tinggi yang mampu proof-reading. Produk PCR kemudian dimurnikan dari adanya kelebihan primer-primer maupun substrat dan enzim yang dipakai pada campuran PCR dengan teknik pemotongan
gel memakai DNA Gel extraction kit. kemudian, hasil pemurnian itu dipakai pada tahap ligasi dengan plasmid pGEX-4T-2 (Pharmacia) yang sudah dipotong
dengan enzim Sma1. Karena enzim yang dipakai untuk proses amplifikasi di atas
adalah enzim Pyrobest yang tergolong enzim yang memiliki tingkat kecermatan tinggi , maka produk PCR yang dihasilkan berbentuk blunt-end. Oleh karena
itu, teknik ligasi yang sesuai adalah teknik blunt-end. Campuran reaksi dari reaksi ligasi itu adalah produk PCR yang telah diphosphorlisasi sebanyak 2 pl ,25ng/pl plasmid pGEX-4T-2 yang telah diphosphorilasi� �1pl kit
ligasu ,kemudian
diinkubasi pada suhu 12 ° C selama 18 jam.
kemudian dilakukan diinkubasi pada suhu 12 °C selama 18 jam. kemudian, dilakukan transformasi dengan E. coli DH5Da dan kemudian ditumbuhkan
pada media LB yang mengandung ampisilin pada suhu 37 °C selama 14 jam. Koloni bakteri yang tumbuh kemungkinan memiliki plasmid rekombinan. Untuk memastikan hal itu, dilakukan skrining koloni yang membawa plasmid itu dengan teknik PCR koloni. Introduksi plasmid pGEX-HB100 ke dalam bakteri inang e coli, DH5a pembawa plasmid rekombian pGEX-HB100 hasil transformasi ditumbuhkan pada media seleksi (ampisilin 50 µl/ml)
yang mengandung X-gal dan IPTG. Koloni bakteri yang berwarna putih kemungkinan membawa plasmid rekombinan pGEX-HB100, sedang koloni bakteri
yang berwarna biru tidak membawa plasmid rekombian,
Koloni E. coli DH5. pembawa plasmid pGEX-HB100 hasil transformasi
yang ditumbuhkan pada media seleksi (ampisilin). Koloni berwarna putih
merupakan koloni bakteri pembawa plasmid rekombinan, sedang koloni
berwarna biru tidak membawa plasmid rekombinan. Untuk memastikan bahwa bakteri bakteri berwarna putih pembawa gen HB100, maka dilakukan skrining dengan PCR memakai koloni bakteri itu sebagai cetakan (PCR Koloni). Primer yang dipakai untuk PCR koloni itu harus dapat mengamplifikasi bagian 5' - insert dan bagian 3' - dari plasmid. ini dilakukan untuk memastikan tidak terjadi kesalahan arah insert. Amplifikasi hanya akan terjadi pada DNA rekombinan yang tidak tersambung secara terbalik.Adanya pita tunggal DNA dari gambar hasil elektroforesis yaitu tanda bahwa klon yang diamplifikasi mengandung plasmid rekombinan. Hasil elektrophoresis dari PCR koloni. M = Marker, 1 dan 2 = E. coli ' DHN5 a , pembawa plasmid pGEX-HB100 sebagai cetakan,
Hasil amplifikasi yang kedua ujungnya berbentuk tumpul (blunt end) itu
memiliki keunggulan sekaligus kelemahan untuk ligasi. Produk PCR yang berujung tumpul memudahkan dalam melakukan proses ligasi, dimana hanya diperlukan 1 jenis enzim restriksi dengan karakteristik memotong secara langsung untuk menghasilkan ujung tumpul juga. Enzim restriksi yang memiliki kemampuan itu diantaranya adalah enzim SmaI. ini akan mengurangi biaya pemakaian untuk pembelian enzim restriksi,
kelemahannya adalah peluang dihasilkannya gen rekombinan yang benar dan yang salah adalah 50%, peluang ligasi ujung tumpul pada salah satu ujung produk PCR dengan ujung hasil pemotongan vektor akan sama dengan peluang ligasi dengan arah yang berlawanan.
Kelemahan akibat kedua ujung tumpul produk PCR itu dapat diatasi melalui
skrining dengan teknik PCR koloni. Primer primer yang dipakai untuk PCR koloni
itu harus dapat mengamplifikasi bagian 5' - insert dan bagian 3' - dari plasmid.
Amplifikasi hanya akan terjadi pada DNA rekombinan yang tidak tersambung secara terbalik. bila gen target tersambung secara terbalik, maka PCR koloni tidak akan menghasilkan pita sesudah elektrophoresis. Koloni yang mengandung plasmid rekombinan dengan hasil PCR koloni pita tunggal kemudian dikultur dari replika pada media LB pada suhu 37 ° C selama 12 jam
dengan goyangan untuk isolasi plasmid rekombinan, terlihat hasil isolasi plasmid rekombinan dengan ukuran sekitar 5.106 pasang basa, yang terdiri dari vektor pGEX-4T-2 mencapai 4.900 pasang basa dan gen target 206 pasang basa,
Plasmid hasil isolasi itu kemudian disekuensing. Hasil sekuensing
nukleotida disejajarkan dengan sekuen asli virus hepatitis B. Pensejajaran
1000 gen insert dengan bagian genom virus Hepatitis B ,
Hasil pensejajaran sekuensing plasmid rekombinan yang diisolasi dari
koloni bakteri rekombinan menandakan kesamaan dengan sekuen dari bagian genom virus hepatitis B. Hal ini menandakan bahwa gen hasil amplifikasi itu tidak mengalami mutasi dan dapat dipakai untuk menghasilkan antigen hepatitis B bagian S pada bakteri. Plasmid rekombinan yang tidak memiliki mutasi pada sekuen insertnya kemudian disimpan untuk ditransformasikan pada E. coli BL21 untuk menghasilkan protein HBsAg100,
