SEL PUNCA LIMBAL
bermacam macam kerusakan jaringan itu bisa disebabkan oleh trauma oleh zat kimia atau mekanik , defisiensi sel punca limbal, transplantasi sel punca limbal (SPL) bisa dipakai untuk memperbaiki struktur dan fungsi pada kerusakan jaringan limbus atau kornea, pengobatan secara autologus dilakukan dengan mentransplantasi mengisolasi SPL dari jaringan pasien sendiri, ada pasien yang harus memperoleh pengobatan secara allogenik,
SPL juga bisa diproduksi dari jaringan limbus donor, produksi SPL secara in vitro memerlukan beberapa faktor lingkungan yang mendukung proliferasi SPL.
faktor-faktor itu antara lain sitokin yang diperlukan untuk komunikasi antar sel,
faktor perkembangbiakan , komponen matriks ekstraseluler, asosiasi molekul-molekul membran sel,
Produksi SPL bisa dilakukan dengan mengurangi diferensiasi SPL dari
mesenchymal stem cell (MSC) yang berasal dari embryonic stem cell (ESC),
jaringan lemak dan talipusat (Wharton’s Jelly),
terbatasnya jumlah donor menjadi kendala untuk penyediaan SPL Pada pengobatan allogenik ,maka perlu pengembangan bermacam macam medium kultur untuk memproduksi SPL untuk menjaga ketersersediaan SPL,
matriks berperan sebagai fasilitator terhadap regulasi sel seperti diferensiasi,tranduksi sinyal, adesi, perpindahan ,Pada kultur sel epitel kornea dan SPL,
Matriks merupakan tempat melekatnya sel dimana sel akan memulai proses
proliferasi atau pembelahan sel, Matriks ekstraseluler berperan dalam menjaga karakterisasi sel punca pada saat kultur,
harus diperhatikan dalam pemilihan jenis matriks adalah manfaat matriks pada saat sel ditransplantasi dan kemampuannya untuk mendukung perkembangbiakan sel saat kultur,
Matriks ektraseluler seperti bovine serum albumin (BSA), membran amnion fibrin, gel, gelatin, fibronectin, kolagen, merupakan matriks yang bisa dipakai
dalam kultur sel punca,
Membran amnion mempunyai kemiripan struktur dengan matriks basal
konjungtiva, Membran amnion bisa diserap tubuh secara bertahap dan aman karena tidak memicu penolakan kekebalan pasien ,Matriks esktraseluler yang bisa dipakai pada saat transplantasi adalah membran amnion, Membran amnion merupakan biomartriks ekstraseluler yang bisa menghambat inflamasi,
pemakaian membran amnion dalam bentuk beku atau segar sudah ada , di
sediaan membran amnion dalam bentuk simpan beku kering setelah
proses deselulerisasi belum ada ,
ketersediaan membran amnion simpan kering beku diperlukan matriks
ekstraseluler tambahan seperti glikoprotein atau kolagen ,
Fibronectin merupakan matriks ekstraseluler golongan glikoprotein yang ada pada kornea fetus, jaringan limbus yang bisa mengurangi aktifitas mitogen,
Fibronectin (FN) sudah dipakai untuk kultur MSC namun belum ada yang mengatakan bukti adanya pemakaian FN untuk kultur SPL,
pemakaian matriks ekstraseluler untuk produksi SPL secara in vitro terus dilakukan untuk memperoleh metode dalam memproduksi .SPL yang efektif mengingat pada setiap sumber dan jenis sel membutuhkan matriks
ekstraseluler yang berbeda-beda. maka perlu dilakukan penelitian untuk
mengetahui ekspresi genetik SPL tikus secara in vitro dan efektifitas FN sebagai matriks ekstraseluler terhadap proliferasi ,
Bahan dan Metode Isolasi Sel Punca limbal Sel punca limba (SPL) yang
dipakai dalam penelitian ini merupakan SPL tikus strain Wistar berumur 3-4 bulan jantan atau betina ,Tikus yang diambil organ mata diterminasi
dengan melakukan anasthesi memakai ketamin dengan dosis 11mg/kg beratbadan dan xylasine dosis 0,05mg/kg beratbadan ,kemudian dilakukan dislocatio cervicalis. Organ mata dibawa ke laboratorium memakai medium transport (posphat buffer saline/PBS yang mengandung 1% penstrep). Isolasi SPL dilakukan di laboratorium dalam Biosafety Cabinet /BSC II. Organ mata dimasukkan kedalam iodine 1% selama 2 menit kemudian dilakukan isolasi SPL dengan menginisiasi bagian konjungtiva melingkar kornea terlebih dahulu. setelah itu dilakukan isolasi SPL yang ada diperbatasan .antara kornea dan konjungtiva , Tikus yang sudah diambil organ matanya dimasukkan ke dalam insenerator, Sel punca limbal yang didapat dicacah memakai gunting kemudian dicuci dalam PBS 1% penstrep sebelum dikultur. Sel punca limbal yang sudah dipotong kecil dikultur dengan dieksplan pada plate dengan 4 well memakai medium kultur,
dengan metode Burman dan Sangwan (2000) dan sedikit modifikasi dilakukan Kultur sel punca limbal . Medium kultur yang dipakai medium α-MEM/F12 dengan suplementasi pensterp 1% ITS (insulin 0,1 mg, transferin 55µg/ml, selenium 5 ng/l) dan 10% FBS, hidrocortisone 0,1 mg/ml) ,EGF/epidermal growth factor (0,01 mg/l), pada suhu 370C, 5% CO2. Penggantian medium kultur dilakukan setiap 2 sampai 3 hari kultur, setelah 13 sampai 15 hari kultur dilakukan passase, saat passase , perhitungan sel dan penanaman
kembali pada cawan yang baru. setelah pasase ke 2, , SPL dikultur dengan memakai membran amnion yang diproduksi oleh BATAN. Membran
amnion direndam PBS. kemudian PBS diganti dengan fibronectin dan dilakukan inkubasi selama 18 jam di dalam inkubator 37 ° C. Keesokan harinya, fibronectin dibuang, diganti dengan suspensi SPL dengan jumlah sel 5x105 untuk luas permukaan membran amnion ± 4,5cm2. Penambahan medium dilakukan setelah SPL menempel pada membran amnion, 4 jam setelah sel ditambahkan pada membran, Menghitung population doubling (PD) dan population doubling time (PDT) SPL Penghitungan dilakukan PD dan PDT dilakukan 6 kali pengulangan (3 rangkap). PD merupakan kemampuan SPL pasase 2 melakukan penggandaan dan dihitung deengan persamaan (1). PDT dihitung berdasarkan persamaan (2). waktu kultur adalah 6 hari (104 jam). golongan perlakuan adalah Sel punca limbal (SPL) yang ditanam dalam cawan dengan FN sebagai matriks ekstraseluler sedang sedang kelompok kendali adalah SPL yang ditanam dalam cawan tidak dengan penambahan fibronectin(FN).
FOTO
1x
FOTO 2x
Karakterisasi Sel Punca Limbal Tahap ini dimulai dengan tahapan isolasi material genetik berbentuk RNA (Ribonucleid Acid), ini untuk melihat ekspresi ABCG2 ,gen CD90, p63 dan Krt/12 pada contoh. contoh yang dilakukan isolasi RNA yaitu Sel punca limbal yang sudah dikultur selama 7 hari dengan memakai dan tidak dengan fibronectin. Proses isolasi RNA dilakukan
dengan memakai manual kit (Qiagen, #52906). Hasil isolasi RNA diteruskan
dengan tes kualitas memakai spektrofotometri yaitu memakai NanodropTM, untuk evaluasi hasil isolasi baik kemurnian dan konsentrasinya , test kemurnian RNA keseluruhan dilakukan dengan cara membanding bandingkan nilai A280 dan A260 , Rasio A260/A280 yang baik yaitu 1.88-2.00 artinya RNA hasil isolasi bebas dari kontaminasi protein. Hasil spektrofotometri yang positif dilanjutkan dengan proses perkembangbiakan. perkembangbiakan material genetik RNA dilakukan dalam 3 tahap antaralain :
tahap 1 pengubahan RNA menjadi RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) atau cDNA memakai kit (Invitrogen, 12574-026)
Tahap 1 dilakukan denaturasi RNA pada suhu 70 °C selama 5 menit,
tahap 2 perkembangbiakan cDNA memakai realtime PCR dengan SYBR
Green PCR Master Mix (AB, #4385610).
tahap 2 dilakukn sintesis komplementari DNA (cDNA) dengan inkubasi pada suhu 25°C selama 5 menit, 42° C selama 60 menit dan 80°C selama 5 meni
Tahap 3 tambahkan 50µl NFW,
perkembangbiakan cDNA memakai mesin Applied Biosystem 7500 fast
Realtime PCR system (AB 7500 realtime PCR) dengan tahapan aktifasi enzim 95áµ’C selama 3 menit, denaturasi 95áµ’C selama 1 sampai 3 detik dan aneling/ektensi 60áµ’C selama 20 detik (40 cycle). PCR dilakukan dengan .primer spesifik gen ABCG2,CD90, p63 dan Krt/12 .
Primer yang dipakai primer khusus yang di rekayasa dan sudah dibuktikan
dengan pengujian BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) pada gene bank
(www.ncbi.nlm.nih.gov) ,
Metode threshold cycle (Ct) dipakai untuk mengetahui kuat lemahnya ekspresi gem, selain itu sistem mesin sudah dilengkapi dengan kalibrator
dye ROX sebagai internal quality kontrol pada setiap reaksi dan 18SS sebagai
housekeeping gene. Pengolahan dan Analisis Data Data dari penelitian ini akan diteliti dan data PD, PD/hari, CT dari ekspresi gen CD 90,Krt12, ABCG2, p63
diteliti dengan test T-test independent. Sedang data PDT diteliti dengan test Mann Whitney memakai SPSS 16.
Hasil penelitian mikroskopis, sel punca limbal bisa tumbuh di sekitar eksplan dari jaringan yang dikultur secara in vitro setelah hari ke 2 kultur lihat foto
Metode ekplan pada kultur sel punca limbal (SPL) tikus. Kultur
menggunakan (A) dan tanpa fibronectin (FN) (B) keduanya menunjukkan
adanya pertumbuhan sel (tanda panah).
Morfologi sel yang tumbuh masih bermacam macam (heterogen) dengan bentuk fibroblastik dan heksagonal , Hasil eksplan limbus pada pemakaian dan tidak dengan fibronectin sebagai matriks ekstraseluler menunjukkan adanya proliferasi sel punca limbal, ini dapat dilihat dengan mikroskopis adanya perpindahan sel punca limbus disekitar eksplan pada kedua
perlakuan.Kultur dan pasase SPL secara in vitro bisa dilakukan 4 sampai dengan 5 kali untuk memperoleh jumlah sel yang cukup , transplantsi maka SPL bisa ditanam pada matriks ekstraseluler seperti membran amnion. membran amnion didapat dari Bank Jaringan BATAN
Kultur sel punca limbal (SPL) tikus secara in vitro pada hari ke 3. SPL
yang dikultur di atas membran tanpa fibronetin (FN) (anak panah) (A) dan
SPL dengan FN (B).
SPL mampu tumbuh pada membran amnion yang sudah dicoating dengan fibronektin. yang tampak dengan adanya perubahan morfologi sel punca limbal di atas permukaan membran amnion,
Tingkat proliferasi sel punca limbal tikus secara in vitro pasase ke 2 pada kendali dan pemakaian fibronectin (FN) mempunyai .Jumlah RNA Krt12, ABG2 dan p63 pada SPL yang dikultur memakai .fibronectin (FN) sebagai attachment factor tidak menunjukkan perbedaan dengan kultur tidak dengan FN (kendali ), namun jumlah RNA CD90 menandakan adanya kenaikan pada sel yang dikultur dengan fibronektin dibandingkan dengan sel yang dikultur tidak dengan penambahan fibronektin (p<0,05) ,
penambahan FN tidak mempengaruhi laju proliferasi SPL dengan melihat pada nilai PDT dan PD kelompok kendali dan perlakuan, itu kemungkinan untuk meningkatkan proliferasi SPL maka diperlukan penambahan
faktor penginduksi pluripotensi lain ,
matriks ekstraseluler seperti fibrin bisa meningkatkan perpindahan SPL pada kultur in vitro maupun pada uji klinis.Pada kultur SPL tikus , pemakaian FN sebagai matriks ekstraseluler bisa dipakai sebelum transplantasi SPL memakai membran amnion. Fibronectin (FN) bisa merupakan molekul adesi yang bisa meningkatkan perpindahan sel dan berpotensi memicu perkembangbiakan sel, ini membantu dalam transplantasi pada kerusakan kornea atau jaringan limbal, walaupun penambahan FN tidak meningkatkan PDT dan PD pada SPL tikus, pada pemakaian FN, secara kualitatif, bisa meningkatkan jumlah SPL yang menempel pada membran amnion , Pada
penempelan sel limbus pada membran amnion akan meningkatkan
proliferasi sel, ini tampak dengan tingkat konfluensi sel yang lebih cepat
pada membran amnion dengan fibronektin, Membran amnion sudah dipakai pada transplantasi bermacam macam penyakit degeneratif dengan memakai bermacam macam tipe sel punca,
Kultur sel punca limbal (SPL) tikus Produksi sel punca limbal bisa dilakukan dengan melakukan kultur pada bagian limbus memakai metode enzimatik maupun eksplan , 10 Kultur limbus dilakukan dengan metode eksplan menunjukkan perkembangbiakan dan proliferasi sel pada penampakan hari ke 3 kultur baik pada .cawan yang tidak memakai fibronectin maupun yang memakai matriks sebagai matriks ekstraseluler , diferensiasi SPL dan Proliferasi menjadi sel epitel kornea tergantung konsentrasi yang optimal,keadaan kultur, Komposisi medium kultur, pemakaian serum dan faktor perkembangbiakan yang tepat bisa meningkatkan diferensiasi dan proliferasi SPL saat di kultur in vitro,
membran amnion didapat dari BATAN yang sudah di simpan beku/freeze dry bisa dipakai untuk memproliferasi SPL tikus. ini bisa terjadi karena reseptor integrin pada SPL bisa berikatan dengan FN yang mempunyai molekul adesi. Ikatan FN dengan integri SPL merupakan permulaan dari aktifitas sel yang lain seperti proliferasi maupun perpindahan sel, pemakaian membran amnion yang sudah mengalami proses aseluler dari sel epitel pada membran amnion tidak menunjukkan peningkatan proliferasi SPL namun bisa memicu perpindahan SPL,
Membran amnion yang sudah disimpan beku juga bisa dipakai untuk kultur SPL, meskipun pada membran amnion setelah simpan beku mempunyai faktor perkembangbiakan lebih rendah dibandingkan yang segar,
bahwa MSC menunjukkan SPL yang didapat dari kultur jaringan limbus
manusia, mengekspresikan gen p63 dan CD90. Populasi MSC yang didapat dari jaringan limbus bisa mendukung perkembangbiakan SPL pada kultur in vitro. pemakaianFN pada kultur SPL tikus dari jaringan limbus tikus tidak
berpengaruh pada kuantitas CD90,RNA ABCG2 dan p63 yang menjadi marker SPL maupun jumlah RNA Krt12 yang merupakan marker sel epitel kornea.
Keberhasilan kultur SPL bisa tampak dengan terekspresinya gen yang menjadi marker SPL seperti ABSC2 dan p63 , Karakteristik sel punca limbal (SPL) tikus Populasi SPL yang mengekspresikan gen p63 mempelihatkan adanya epithelialmesenchymal transition (EMT) yang mempunyai sifat multipotensi seperti mecenchymal stem cell (MSC), Secara molekuler karakter MSC harus mengekspresikan CD73 positif ,CD105, CD90,
dan mampu berdiferensiasi menjadi sel adiposit,osteosit, kondrosit ,
SPL yang bisa terisolasi memakai metode .eksplan menunjukkan adanya CD90 dan RNA p63 yang tinggi ,
Penambahan serum autologus bisa mengurangi suplemen yang berasal dari
binatang sehingga bisa mengurangi kontaminasi dan transmisi penyakit dari
binatang, bisa terdeteksinya RNA Krt12 menandakan bahwa SPL yang dikultur memakai komposisi medium kemungkinan bisa mengalami diferensiasi spontan. yang tampak dengan rendahnya nilai Ct gen Krt12 pada perlakuan dan kendali , Penambahan EGF pada medium bisa mengurangi transforming growth factor-β (TGF-β) yang akan memicu diferensiasi SPL menjadi sel epitel kornea, Kandungan growth factor di dalam serum yang mengandung TGF-β sebagai pemicu diferensiasi spontan saat kultur SPL.
pemakaian suplemen dalam medium kultur sangat mempengaruhi
diferensiasi dan proliferasi SPL, suplemen pada medium kultur yang dipakai adalah EGF ,10% FBS, ITS dan hidrokortison , penambahan serum
autologus untuk proliferasi SPL memperlihatkan ekspresi SPL dan tingkat proliferasi yang lebih baik,
foto Kultur sel punca limbal (SPL) tikus secara in vitro pada hari ke 3. SPL
yang dikultur di atas membran tidak dengan fibronetin (FN) (anak panah) (A) dan
SPL dengan FN (B).
foto Metode ekplan pada kultur sel punca limbal (SPL) tikus. Kultur
memakai (A) dan tidak dengan fibronectin (FN) (B) keduanya menunjukkan
adanya perkembangbiakan sel (tanda panah
Tabel Kuantitasi RNA berdasarkan Ct pada kelompok kontrol dan perlakukan
Krt 12 ABCG2 p63 CD90
perlakuan (FN) 18,42±1,87 17,08±1,56 19,75±2,18 17,70±2,90
kendali 18,85±0,76 17,42±0,52 19,09±3,03 15,23±2,65
Tabel PD dan PDT limbal tikus pasase 2 yang dikultur secara in vitro
PD PDT (jam) PD/hari
perlakuan (FN) 2,11±0,44 61,46±18,3 0,42±0,11
kendali 2,13±0,48 57,65±18,3 0,44±0,09
